Fungal Extracellular Lipases from Coffee Plantation Environments for the Sustainable Management of Agro-Industrial Coffee Biomass

Abstract

Coffee wastes have large amounts of by-products rich in phenolic compounds such as chlorogenic and caffeic acid, with potential applications for developing fine chemicals such as caffeic acid phenethyl ester (CAPE). A screening for microorganisms was undertaken in a coffee plantation environment to isolate native tropical species able to modify secondary metabolites present in this kind of biomass enzymatically. From the screening, 130 fungal strains could grow in lipase inducer media. Fungal strains were identified via ITS-based sequencing. Classification based on BLAST assigned 51 isolates to 12 different genera, including Absidia, Aspergillus, Cunninghamella, Fusarium, Metarhizium, Meyerozyma, Mucor, Neocosmospora, Papiliotrema, Penicillium, Rhizopus, and Trichoderma. DNA sequencing identified 14 putative extracellular lipases. According to the extracellular lipase activity, the most promising strain was identified as Fusarium sp. by DNA barcoding. Extracellular lipases from this strain exhibited maximal hydrolytic activity at a temperature of 45 °C, a pH of 7.00, and 200 ppm of NaCl, with an affinity towards substrates having carbon chain lengths of 8 or longer. Under these conditions, lipase instead of esterase activity is the main feature. The Km and Vmax values calculated using p-nitrophenyl palmitate (pNPP) as hydrolysis substrate were 0.003 mM and 299.8 μmol min−1 mg−1, respectively. Fusarium sp. lipases presented high stability during freeze–thawing, allowing the storage of enzyme solutions at −20 °C, but not as a lyophilized powder. According to our kinetic study, these lipases catalyzed CAPE hydrolysis, showing a progressive decrease in the concentration of the CAPE and a correspondent increase in the caffeic acid concentration as a product of this hydrolysis. Being able to carry out this type of reaction under mild conditions shows that Fusarium sp. lipases recognize CAPE as substrate and suggest CAPE synthesis (reverse reaction) and transformation can be engineered, using caffeic acid from coffee biomass, as a potential industrial application for these lipases.

Los desechos del café tienen grandes cantidades de subproductos ricos en compuestos fenólicos como el ácido clorogénico y cafeico, con aplicaciones potenciales para el desarrollo de productos químicos finos como el éster fenetílico del ácido cafeico (CAPE). Se realizó un screening de microorganismos en un ambiente de plantación de café para aislar especies tropicales nativas capaces de modificar enzimáticamente metabolitos secundarios presentes en este tipo de biomasa. A partir del análisis, 130 cepas de hongos pudieron crecer en medios inductores de lipasa. Las cepas de hongos se identificaron mediante secuenciación basada en ITS. La clasificación basada en BLAST asignó 51 aislados a 12 géneros diferentes, incluidos Absidia, Aspergillus, Cunninghamella, Fusarium, Metarhizium, Meyerozyma, Mucor, Neocosmospora, Papiliotrema, Penicillium, Rhizopus y Trichoderma. La secuenciación del ADN identificó 14 supuestas lipasas extracelulares. Según la actividad de la lipasa extracelular, la cepa más prometedora fue identificada como Fusarium sp. mediante códigos de barras de ADN. Las lipasas extracelulares de esta cepa exhibieron actividad hidrolítica máxima a una temperatura de 45 °C, un pH de 7,00 y 200 ppm de NaCl, con una afinidad hacia sustratos que tienen longitudes de cadena de carbono de 8 o más. En estas condiciones, la característica principal es la actividad lipasa en lugar de la esterasa. Los valores de Km y Vmax calculados utilizando palmitato de p-nitrofenilo (pNPP) como sustrato de hidrólisis fueron 0,003 mM y 299,8 μmol min-1 mg-1, respectivamente. Fusariumsp. Las lipasas presentaron alta estabilidad durante la congelación-descongelación, lo que permitió el almacenamiento de soluciones enzimáticas a -20 °C, pero no como polvo liofilizado. Según nuestro estudio cinético, estas lipasas catalizaron la hidrólisis de CAPE, mostrando una disminución progresiva en la concentración de CAPE y un correspondiente aumento en la concentración de ácido cafeico como producto de esta hidrólisis. Poder realizar este tipo de reacciones en condiciones suaves demuestra que Fusarium sp. Las lipasas reconocen a CAPE como sustrato y sugieren que se puede diseñar la síntesis de CAPE (reacción inversa) y la transformación, utilizando ácido cafeico de la biomasa del café, como una posible aplicación industrial para estas lipasas.