Evaluación del papel de los neutrófilos (PMNs) en la patología producida por Clostridioides (Clostridioides) difficile utilizando un bio-modelo murino

Abstract

Clostridioides difficile es una bacteria enteropatógena responsable de brotes graves de infecciones intrahospitalarias y casos de diarreas esporádicas a nivel mundial. Causa un cuadro conocido como diarrea asociada a C. difficile (DACD), la cual puede evolucionar a colitis pseudomembranosa, megacolon tóxico e inclusive hasta la muerte. La patogénesis de la infección por C. difficile primordialmente depende de sus principales factores de virulencia, la toxina A (TcdA) y la toxina B (TcdB) capaces de ocasionar una potente alteración del tejido intestinal, disrupción epitelial, retención de líquidos, inducción de una intensa respuesta inflamatoria y exacerbada infiltración de PMNs. Esta última característica clínica es determinante en la severidad de la enfermedad, sobre todo, cuando hay estímulos inflamatorios continuos provocando una inflamación de tipo crónico desencadenando una desregulación neutrofílica. A pesar de que se sabe que los neutrófilos (PMNs) juegan un papel importante en la patología de esta infección, no existen estudios in vivo que utilicen estrategias de agotamiento de PMNs expuestos a las toxinas de C. difficile en el lumen intestinal evaluando directamente el papel de estas células inmunes en la patología desencadena por las toxinas de C. difficile. Por esa razón, esta investigación evaluó el efecto en la respuesta inflamatoria, actividad mieloperoxidasa (MPO) y efectos histopatológicos inducidos por las toxinas de C. difficile en presencia o ausencia de PMNs. Para esto se utilizó un biomodelo reduccionista de asa intestinal ligada combinado con un modelo de ratones neutropénicos y no neutropénicos a los cuales se les inocularon las toxinas purificadas combinadas TcdAVPI10463/003+TcdBNAP1/027, y por separado TcdAVPI10463/003, TcdBNAP1/027 y TcdBNAP1/019 de C. difficile. Adicionalmente, se evaluó la capacidad de los PMNs humanos y murinos de fagocitar y asociarse a los clostridios diseñando un modelo in vitro. La capacidad fagocítica de los PMNs de ratón fue más eficiente que la de los PMN de humanos. En los ratones, la disminución de la cantidad de plaquetas en sangre favoreció aún más el proceso de asociación (fagocitosis) de los PMNs frente a los clostridios. En el modelo in vivo, se observó que la depleción parcial de los PMNs, tanto periférica como tisularmente, generó una disminución en el nivel de patogénesis producida por las toxinas de C. difficile, ocasionando una reducción significativa de la respuesta proinflamatoria, inflamatoria, indicadores de daño histopatológico y actividad MPO. La reducción de estos efectos fue observada mayormente con la enterotoxina TcdA. En contraste, también se logró identificar que la exotoxina TcdBvNAP1 posee una actividad histopatológica casi similar a la TcdBNAP1. Estos resultados sugieren que, durante el proceso de inflamación los PMNs promueven parte del proceso patológico, debido a la desregulación que se observa durante la patogénesis producida por las toxinas TcdA y TcdB en la infección causada por C. difficile. Este estudio permitió mejorar el conocimiento sobre el papel de los PMNs frente a las toxinas TcdA y TcdB en un ambiente fisio-patológico real con la interacción de las múltiples señales tisulares generadas por estas toxinas.

Clostridioides difficile is an enteropathogenic bacterium responsible for severe outbreaks of in-hospital infections and cases of sporadic diarrhea worldwide. It causes a clinical manifestation known as diarrhea associated with C. difficile (DACD), which can lead to pseudomembranous colitis, toxic megacolon, and even death. The pathogenesis of C. difficile infection primarily depends on its main virulence factors, toxin A (TcdA) and toxin B (TcdB) capable of causing a potent alteration of the intestinal tissue, epithelial disruption, fluid retention, induction of an intense inflammatory response, and exacerbated infiltration of PMNs. This last clinical feature is decisive for the severity of the illness, especially when continuous inflammatory stimuli are causing chronic inflammation, triggering neutrophilic dysregulation. Although it is known that neutrophils (PMNs) play an important role in the pathology of this infection, there are no in vivo studies that use depletion strategies for PMNs exposed to C. difficile toxins in the intestinal lumen, directly evaluating the role of these immune cells in the pathology triggered by C. difficile toxins. For that reason, this investigation evaluated the effect on the inflammatory response, myeloperoxidase (MPO) activity, and histopathological effects induced by C. difficile toxins in the presence or absence of PMNs. For this purpose, a reductionist intestinal ligated loop bio-model was used, combined with a neutropenic and non-neutropenic mice model to which they were inoculated with the combined purified toxins TcdAVPI10463/003+TcdBNAP1/027, and separately TcdAVPI10463/003, TcdBNAP1/027 and TcdBNAP1/019 from C. difficile. Additionally, the ability of human and murine PMNs to phagocytize and associate with clostridia was evaluated by designing an in vitro model. The phagocytic capacity of mice PMNs was more efficient than human PMNs. In mice, the decrease in the number of platelets in the blood improved the process of association (phagocytosis) of PMNs against clostridia. In the in vivo model, it was observed that the partial depletion of PMNs, both peripherally and titularly, generated a decrease in the level

of pathogenesis produced by C. difficile toxins, causing a significant reduction in the pro- inflammatory, inflammatory, indicators of histopathological damage and MPO activity. The

reduction of these effects was observed mainly with the TcdA enterotoxin. In contrast, it was also possible to identify that TcdBvNAP1 exotoxin has a histopathological activity as TcdBNAP1. These results suggest that, during the inflammation process, PMNs promote part of the pathological process, due to the dysregulation that is observed during the pathogenesis produced by the TcdA and TcdB toxins in the infection caused by C. difficile. This study improved our knowledge about the role of PMNs against TcdA and TcdB toxins in a real pathophysiological environment with the interaction of the multiple cellular signals generated by these toxins.