Identificación morfológica, morfométrica y molecular de especies de Helicotylenchus (Tylenchida: Hoplolaimidae) asociadas a seis cultivos en Costa Rica

Abstract

Los nematodos fitoparásitos son patógenos pero sus interacciones con otros agentes causantes de enfermedades dificultan medir su verdadero impacto en el rendimiento de los cultivos y su estimativo a gran escala. En este sentido, la correcta identificación de especies se vuelve una tarea importante para determinar a cuáles cultivos pueden estar asociadas y su potencial daño. El objetivo del presente estudio fue identificar especies del nematodo Helicotylenchus asociadas a los cultivos de piña en San Carlos, Alajuela; cítricos en Los Chiles, Alajuela; Uva en Santa Ana, San José; plátano en Talamanca, Limón; banano en Jicaral, Puntarenas y arroz en Paso Canoas, Puntarenas. Se realizaron estudios morfológicos, morfométricos y moleculares. Se llevaron a cabo un total de 3000 mediciones morfométricas, que facilitó la estadística descriptiva de cada población de nematodos. Se tomó un total de 2500 microfotografías de hembras y machos que permitieron discriminar entre las especies de Helicotylenchus asociadas a los cultivos muestreados. Por medio de la reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se amplificó el dominio D2-D3 de la región 28S del ADN ribosomal (ADNr) con los cebadores D2A (5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’) y D3B (5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’). Asimismo, se amplificó la región ITS entre los genes ribosomales nucleares con los cebadores TW81 (5’-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’) y AB28 (5’-ACGAGCCGAGTGATCCACCG-3’). Los productos de PCR se purificaron previos a la secuenciación y cada secuencia, se comparó con otras reportadas para especies de Helicotylenchus depositadas en el GenBank®. Se calcularon los porcentajes de similitud y divergencia entre ellas. Para los análisis filogenéticos se utilizaron las secuencias de las regiones 28S e ITS del ADNr de las diferentes especies de Helicotylenchus reportadas en el GenBank®. Se establecieron relaciones filogenéticas entre las especies identificadas a partir de los tres marcadores moleculares utilizando el método de Inferencia Bayesiana (IB). La información molecular se comparó con la morfológica y morfométrica para obtener una correcta identificación de la especie encontrada en cada cultivo. La especie Helicotylenchus dihystera, se encontró asociada a plantaciones de piña, cítricos, plátano y uva. Por su parte, la especie H. multicinctus se identificó en asocio al cultivo de banano. En el caso del cultivo del arroz no fue posible identificar la especie asociada, por lo que será necesario utilizar molecularmente otras regiones conservadas del ADN que permitan suministrar más información. Las secuencias obtenidas para H. dihystera presentaron un 99% de similitud con accesiones correspondientes a esta especie reportadas en los cultivos de morera y ñame en China y a Camellia sp. en Birmania. En cuanto a las secuencias de la especie H. multicinctus, estas mostraron un 99% de similitud con accesiones correspondientes a esta especie, encontradas en el cultivo de Musa paradisiaca en China y cacao en Sudáfrica. En el caso de la población de Helicotylenchus presente en el cultivo de arroz, el análisis de la amplificación del dominio D2-D3 de la región 28S del ADN ribosomal (ADNr) mostró resultados porcentuales de similitud de 96% con accesiones correspondientes a la especie H. caudatus, por debajo de los necesarios para poder confirmar a cuál especie pertenecía. El árbol filogenético correspondiente al análisis de las secuencias de la región ITS mostró a H. dihystera agrupando con accesiones encontradas en Japón. Además, la secuencia de la especie H. multicinctus agrupó con una accesión reportada en China. La correcta descripción de especies representa un método importante para la generación de información científica que permita llevar a cabo registros de plagas y hospederos, su localización y el impacto en el rendimiento de las plantaciones. De esta forma, se logra contar con suficiente información para ser utilizada en el desarrollo de programas cuarentenarios y estrategias de combate.

Plant-parasitic nematodes are pathogens, but their interactions with other disease-causing agents make it difficult to measure their true impact on crop yields and their estimation on a large scale. In this sense, the correct identification of species becomes an important task to determine which crops they may be associated with and their potential damage. The objective of the present study was to identify species of the nematode Helicotylenchus associated with pineapple crops in San Carlos, Alajuela; citrus in Los Chiles, Alajuela; grape in Santa Ana, San José; banana in Talamanca, Limón; banana in Jicaral, Puntarenas and rice in Paso Canoas, Puntarenas. Morphological, morphometric and molecular studies were carried out. A total of 3000 morphometric measurements were carried out, which facilitated the descriptive statistics of each nematode population. A total of 2500 microphotographs of females and males were taken to discriminate between the Helicotylenchus species associated with the sampled cultures. Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the D2-D3 domain of the 28S ribosomal DNA (rDNA) region with primers D2A (5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3') and D3B (5'-TCGGAAGGAAGGAACCAGCTACTA-3'). Also, the ITS region between the nuclear ribosomal genes was amplified with primers TW81 (5'-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3') and AB28 (5'-ACGAGCCGAGTGATCCACCG-3'). PCR products were purified prior to sequencing and each sequence was compared to other sequences reported for Helicotylenchus species deposited in GenBank®. The percentages of similarity and divergence between them were calculated. For phylogenetic analyses, the sequences of the 28S and ITS regions of the rDNA of the different Helicotylenchus species reported in GenBank® were used. Phylogenetic relationships between the species identified from the three molecular markers were established using the Bayesian Inference (BI) method. Molecular information was compared with morphological and morphometric information to obtain a correct identification of the species found in each crop. The species Helicotylenchus dihystera was found associated with pineapple, citrus, banana and grape plantations. The species H. multicinctus was identified in association with the banana crop. In the case of rice cultivation, it was not possible to identify the associated species, so it will be necessary to use other conserved regions of DNA molecularly to provide more information about the species information. The sequences obtained for H. dihystera showed 99% similarity with accessions corresponding to this species reported in mulberry and yam crops in China and Camellia sp. in Burma. As for the sequences of the species H. multicinctus, these showed 99% similarity with accessions corresponding to this species, found in the cultivation of Musa paradisiaca in China and cocoa in South Africa. In the case of the Helicotylenchus population present in the rice crop, the analysis of the amplification of the D2-D3 domain of the 28S ribosomal DNA region (rDNA) showed percentage similarity results of 96% with accessions corresponding to the species H. caudatus, below those necessary to confirm which species it belonged to. The phylogenetic tree corresponding to the analysis of the ITS region sequences showed H. dihystera grouping with accessions found in Japan. In addition, the sequence of the species H. multicinctus grouped with an accession reported in China. The correct description of species represents an important method for the generation of scientific information that allows pest and host records, their location and impact on the performance of plantations. In this way, sufficient information is available to be used in the development of quarantine programs and control strategies.