Evaluación de efectos tóxicos tempranos tras la exposición de peces (Parachromis dovii) a una mezcla de Clorpirifos y Difenoconazol, a través de la respuesta de una batería de biomarcadores bioquímicos e histopatológicos

Abstract

En Costa Rica, la agricultura es una de las actividades económicas más importantes. El clorpirifos (CPF) y el difenoconazol (DFZ) han sido identificados como plaguicidas ampliamente utilizados en los cultivos de banano y piña en el Caribe del país y se registran constantemente en los ecosistemas acuáticos, lo que representa un riesgo para las especies acuáticas no objetivo. Tradicionalmente se han estudiado los efectos de las sustancias individuales, pero se sabe que, en los ecosistemas, generalmente los organismos se ven expuestos a varias sustancias simultáneamente. Además, se considera relevante la utilización de biomarcadores en los estudios ecotoxicológicos, ya que son herramientas rápidas, sensibles y señales de alerta temprana en los ecosistemas. Por lo tanto, en este trabajo se estudió la toxicidad del insecticida organofosforado clorpirifos y del fungicida triazol difenoconazol en Parachromis dovii para contribuir a la comprensión de su toxicidad potencial. En la primera parte de la investigación, se obtuvieron los CL50 para cada sustancia a partir de pruebas agudas de 96 horas. Luego, se realizó la exposición a concentraciones subletales de ambas sustancias (10% de CL50) individualmente y en mezcla, con el fin de evaluar las respuestas de los biomarcadores. Se midieron las actividades de la etoxiresorufina-O-detilasa (EROD), la catalasa (CAT) y la glutatión-S-transferasa (GST), así como la peroxidación de lípidos (LPO) en tejidos hepáticos y branquiales como marcadores de los procesos de biotransformación y estrés oxidativo. Además, se cuantificó en el cerebro y músculo la actividad de la colinesterasa (ChE) como un biomarcador de neurotoxicidad, así como la actividad lactato deshidrogenasa (LDH) en músculo para el estudio de algunos procesos de costo energético. Los CL50 obtenidos fueron 55,34 μg/L (CI del 95%: 51,06 a 59,98) para el clorpirifos y 3250 μg/L (CI del 95%: 2770 a 3810) para el difenoconazol. En cuanto a los biomarcadores, se registró una inhibición significativa de la actividad de la colinesterasa en cerebro y músculo de los peces expuestos a 5,50 μg/L de clorpirifos. No se produjo una inhibición cuando los peces fueron expuestos a la mezcla de clorpirifos con difenoconazol. Por otro lado, se observaron cambios significativos en la actividad de la LDH en peces expuestos a 325 μg/L de difenoconazol, así como, un aumento significativo en la actividad de EROD en el hígado de los peces expuestos a la mezcla. Estos resultados sugieren efectos nocivos del insecticida clorpirifos en concentraciones similares a las que se reportan frecuentemente en el ambiente. Además, hay evidencia de una interacción de ambas sustancias que afecta el metabolismo de la biotransformación a niveles subletales de exposición. En la segunda parte de la investigación, se realizó un ensayo de 14 días de exposición a la mezcla de plaguicidas (5,50 μg/L CPF + 325 μg/L DFZ). Cambios histológicos se evaluaron de forma semicuantitativa y se registraron según la frecuencia de aparición después de cada tratamiento (presencia/ausencia). Las alteraciones branquiales incluyeron hiperemia, infiltraciones celulares, fusiones y acortamiento. La hiperemia y las infiltraciones celulares en los peces expuestos a la mezcla de plaguicidas mostraron cambios significativos con respecto al control. Se observaron lesiones de degeneración lipídica y vacuolar, sugiriendo alteraciones hepáticas, sin embargo, no se observaron cambios significativos con respecto a los controles. Este estudio concluyó que las concentraciones subletales de CPF y DFZ en una exposición subcrónica inducen alteraciones importantes a nivel histológico, principalmente en las branquias, además se sugiere que este tipo de biomarcadores resultan útiles para complementar la evaluación de la exposición y los efectos de la mezcla de plaguicidas en estudio.

In Costa Rica, agriculture is one of the most important economic activities. Chlorpyrifos and difenoconazole have been identified as agrochemicals widely used in banana and pineapple crops in the Caribbean area of the country and are constantly recorded in aquatic ecosystems, posing a risk to non-target species. In ecotoxicology, the effects of individual substances are generally studied, but it is known that in ecosystems, organisms are exposed to several substances simultaneously. In addition, the use of biomarker´s batteries in ecotoxicological studies is considered relevant, as they are rapid, sensitive tools and a way to obtain early warning signals from ecosystems. Therefore, the toxicity of the organophosphate insecticide chlorpyrifos and the fungicide difenoconazole in Parachromis dovii was studied in this work. In the first stage of the investigation, LC50 were obtained for each substance from acute 96- hour tests. Exposure to sublethal concentrations of both substances (10% of LC50) individually and in mixture was then performed in order to evaluate the responses of the biomarkers. The activities of ethoxy-resorufin-O-detilase (EROD), catalase (CAT) and glutathione-S-transferase (GST), as well as lipid peroxidation (LPO) in liver and gill tissues were measured as markers of biotransformation processes and oxidative stress. In addition, in the brain and muscle, cholinesterase activity (ChE) was quantified as a biomarker of neurotoxicity, as well as lactate dehydrogenase (LDH) activity in muscle for the study of energy-cost processes. The LC50 obtained were 55.34 μg/L (95% CI 51.06 to 59.98) for chlorpyrifos and 3250 μg/L (95% CI 2770 to 3810) for difenoconazole. As for biomarkers, significant inhibition of brain and muscle cholinesterase activity was recorded in fish exposed to 5.50 μg/L chlorpyrifos. Inhibition was not observed when fish were exposed to the mixture of chlorpyrifos with difenoconazole. On the other hand, significant changes in LDH activity were observed in fish exposed to 325 μg/L difenoconazole, while there was a significant increase in EROD activity in the liver of fish exposed to the mixture. These results suggest harmful effects of the insecticide chlorpyrifos at environmentally relevant concentrations. In addition, there is evidence of an interaction of both substances that affects the metabolism of biotransformation at sublethal levels of exposure. In the second part of the investigation, a 14-day trial of exposure to the pesticide mixture was conducted at the above-mentioned concentrations. Histological changes were evaluated semi-quantitatively and recorded according to the frequency of occurrence after each treatment (presence/absence). Branchial alterations included hyperemia, cell infiltrations, fusions and shortening. Hyperemia and cellular infiltrations in fish exposed to the pesticide mixture showed significant changes with respect to control. Lipid and vacuolar degeneration were observed, suggesting liver alterations, however, not observing specific changes with respect to controls. This study concluded that the sublethal concentrations of CPF and DFZ in a subchronic exposure induce significant histological alterations, mainly in the gills. It is also suggested that this type of biomarkers are useful to complement the exposure assessment and the effects of the pesticide mixture under study.